주기적 모발 재생 가능성이있는 상피 줄기 세포의 확장 및 특성화

주기적 모발 재생 가능성이있는 상피 줄기 세포의 확장 및 특성화

요약

포유류에서 장기 유도는 모낭 (HF)을 제외하고 배아 발달 중에 만 발생합니다. 그러나 반복적 인 HF 재생을 담당하는 HF 상피 줄기 세포 (HFSC)는 완전히 특성화되지 않았습니다. 여기, 우리는 HFs를 재생성하는 HFSCs의 능력을 제어 할 수있는 체외 배양 시스템을 설정합니다. 재생을위한 HF의 수를 정밀하게 제어 한 방법을 기반으로, 기능 분석에 따르면 CD34 / CD49f / 인테그린 β5 (Itgβ5)-트리플 양성 (CD34 + / CD49f + / Itgβ5 +) 세포는 연속적인 모발 재생을위한 다 분화능 및 기능적 중요성을가집니다. 네이티브 HF에서 이러한 세포는 벌지 영역의 가장 윗부분에 있으며 생쥐와 인간의 테나 신으로 둘러싸여 있습니다.

소개

Organogenesis는 배아 신체 계획에 따라 각 기관 형성 분야에서 조직 자기 조직화, 세포-세포 상호 작용, 신호 분자의 조절 및 세포 운동성을 포함하는 복잡한 과정을 통해 배아 발달 동안에 만 발생합니다. 배아 발달 과정에서 대부분의 장기는 장기 유도 잠재력을 가진 상피 줄기 세포와 중간 엽 줄기 세포 사이의 상호 상호 작용에 의해 유도되는 장기 세균에서 발생합니다. 이 세포들은 출생 후 잠재력을 잃습니다. 배아 기관 발생을 모방함으로써, 우리는 이전에 배아 기관 유도 잠재 줄기 세포 1 , 2 , 3 , 4 , 5 에서 모낭 (HF)을 포함한 외배엽 기관의 완전한 기능 재생 개념을 입증했습니다 .6 . 또한, 원래 기관의 구조와 기능을 부분적으로 요약하고 여러 유형의 성인 조직 줄기 세포에서 파생 된 오르가 노이드의 성공적인 생성은 적어도 파트 7 에서 이러한 세포의 장기 유도 잠재력을 입증했습니다. 그러나 HFs 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6을 제외하고는 성체 조직 줄기 세포를 활용 한 전체 장기의 기능적 재생이 이루어지지 않았습니다.

모낭의 가장 매력적인 특징은 출생 후 주기적으로 모낭 재생을 겪는 능력입니다. 포유류의 HF는 크게 두 개의 주요 영역으로 나뉩니다 : 돌출 영역, infundibulum, isthmus 및 피지선을 포함하는 영구적 인 상부 부분; 및 모간이 생성 된 모발 매트릭스 및 분화 된 상피 세포를 포함하는 가변 하부를 포함한다. 개인의 일생 동안 가변 하부는 모발주기를 구성하는 성장 (성장기) 및 정지 (휴지기)의주기적인 기간을 겪습니다. 이 과정은 사이토 케라틴 15 (CK15) 또는 CD34 양성 벌지와 Lgr5 양성 이차 모발 배아 (sHG)에 존재하는 HFSC와 중간 엽 진피 유두 세포 (DPC) 8 , 9 사이의 상호 상호 작용에 의해 구동됩니다.(그림  1 a). HF는 또한 HF의 상부를 유지하는 역할을하는 여러 유형의 운명 제한 줄기 세포를 보유합니다. 이러한 세포는 Lgr6, Lrig1 및 Blimp1 10 , 11 , 12 와 같은 단백질을 발현합니다 (그림  1a ). HFSC 중 CK15-, Lgr5-, Lgr6- 및 Lrig1- 발현 세포와 같은 여러 줄기 세포는 가소성을 보여주고 전체 두께의 상처뿐만 아니라 모발 재구성 분석 내에서 전체 HF를 재생하는 능력을 가지고 있습니다 9 , 10 , 11 , 13. 따라서 성인 HFSC는 장기 재생 의학의 유망한 후보가 될 수 있으며, HF 재생을 지속적으로 유도 할 수있는 능력을 가진 HFSC를 효율적으로 확장하는 방법이 필요합니다. 그러나 기능적 이질성이 존재하는지 여부와 그렇다면 어떤 유형의 줄기 세포가 장기간 모발주기를 유지할 수 있는지는 명확하지 않지만, 단세포 분석은 CD34와 같은 동일한 줄기 세포 마커를 발현하는 세포 집단간에 이질성을 분명히 보여주었습니다. 및 CD49f 이중 양성 세포 집단 (CD34 + / CD49f +), 벌지 HFSC 14에 대한 잘 확립 된 마커 .

그림 1

HFCS의 상태를 제어 할 수있는 배양 조건 식별. ( a ) 마우스 pelage HF 및 HFCS 유지 및 활성화에 기여하는 신호 전달 경로에서보고 된 HFSC의 개략도. ( b ) HF 벌지 상피 세포에 대한 3D 세포 배양의 실험 계획. 상피 세포는 성장기, 성장기 또는 휴지기의 등 피부, 휴지기 (pelage HFs 포함)에서 성체 마우스 비 브리사의 돌출부로부터 미세 해부 및 후속 효소 처리에 의해 분리되었다. ( c ) 3D 배양에서 표시된 시점에서 성인 마우스 vibrissa (상단 패널) 또는 pelage HF (하단 패널)에서 분리 된 배양 된 세포의 위상차 이미지. ( d) NFFSE 배지에서 배양 된 스페 로이드 크기의 정량화 분석. 빈도는 새로 분리되고 배양 된 표피 세포에 표시된 마커에 대한 1,000 개의 스페 로이드 ( e ) 복제 FACS 플롯 에서 계산되었습니다 . ( f ) 새로 분리되거나 배양 된 세포에서 표시된 마커의 복제 qPCR 분석. ( g ) C57BL / 6 또는 Lgr5-EGFP 마우스의 천연 비 브리사 HF, 펠라 지 HF 및 배양 된 스페 로이드상의 표시된 마커의 대표적인 면역 형광. 파선은 상피와 진피 사이의 경계를 나타냅니다. sg, 피지선. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. * p <0.001; ** p <0.002. 스케일 바, 20 μm. 보충 그림 S1 도 참조하십시오 .

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HFSC의 유지, 증식 및 분화를 조절하는 분자 메커니즘은 유전 적 기능 획득 및 기능 상실 연구 8 , 13 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20을 통해 광범위하게 특성화되었습니다 . (그림  1ㅏ). 가장 놀랍게도 BMP 억제와 수반되는 Wnt 활성화는 HFSC의 활성화를 시작하고 후속 Shh 활성화는 HFSC 자손의 운명을 더 낮은 HF 영역으로 지정합니다. 반면에, Wnt 및 Notch 신호 전달의 활성화는 HFSC와 피지선의 분화에 관여합니다. 이러한 분자 메커니즘을 모방함으로써 성인 마우스 등 피부에서 분리 된 CD34 + / CD49f + 세포는 Matrigel 또는 유형 I 콜라겐을 스캐 폴드 및 EGF, FGF2 및 VEGF-를 포함하는 배지로 사용하는 3D 배양에 의해 14 일 내에 5 배로 증폭 될 수 있음이 입증되었습니다. A 21 , 22. 더욱이,이 선구적인 연구는 비 HFSC에서 HFSC의 새로운 생성을 자체 조직 방식으로 보여주고 성공적인 HF 재생 치료의 문을 엽니 다. 그러나 이러한 세포에주기적인 모발 재생을 담당하는 HFSC가 포함되어 있는지 여부는 명확하지 않습니다.

여기, 우리는 생물 공학 HF 세균에서 재생 된 HF의 장기적인 모발주기를 유지할 수있는 HFSC의 하위 집단을 식별합니다. 우리는 마우스 HFSC의 분화 상태를 제어 할 수있는 배양 조건을 확립했습니다. 상이한 조건에서 배양 된 세포 집단의 비교는 CD34 및 CD49f 이중 양성 세포 집단 (CD34 + / CD49f +) 중에서 인테그린 β5 (Itgβ5)-양성 세포가 세포 배양에서 풍부하다는 것을 보여 주었다. 생물 공학 HF 세균에서 CD34 + / CD49f + / Itgβ5 + 세포를 회수하면 제한된 기간의 모발주기가 발생합니다. 천연 모낭에서 CD34 + / CD49f + / Itgβ5 + 삼중 양성 세포는 마우스와 인간 모두에서 테나 신을 둘러싼 벌지 영역의 최상부 영역에서 발견되었습니다. 집합 적으로

결과

CD34 / CD49f 이중 양성 벌지 세포를 효율적으로 확장하기위한 3D 배양 시스템 구축

지난 10 년 동안 새로운 3D 배양 시스템을 사용하여 장기 유도 잠재력을 가진 많은 줄기 세포가 확인되어 장기 유도 줄기 세포가 줄기 세포 자체와 미세 환경 틈새를 모두 포함하는 오르가 노이드를 자체 조직 방식으로 생성 할 수 있습니다. 23 .

장기 주기적 HF 재생에 없어서는 안될 HFSC를 식별하기 위해 HFSC가 주기적으로 모발 재생을 유도하는 능력을 유지하거나 잃을 수있는 배양 조건을 최적화 한 다음 이러한 다양한 조건에서 배양 된 세포 집단을 비교했습니다. 우리는 HFSC뿐만 아니라 틈새 세포를 포함하여 벌지 영역의 모든 세포를 표적화했기 때문에 미세 해부 및 후속 효소 처리를 통해 모발주기의 다양한 단계에서 비 브리사 HF에서 벌지 영역의 모든 세포를 분리했습니다. 우리는 HFSC 8 , 13 , 15 , 16 , 17 의 증식 및 유지에 대한 220 개 이상의 세포 외 기질 (ECM) 조합과 이전에 정의 된 사이토 카인 통찰력을 조사했습니다., 18 , 19 , 20 , 21 (그림  1 a, b). 배양 6 일째에 단일 상피 세포를 Noggin, FGF-7, FGF-10, 음파 고슴도치 작용제 및 EGF (NFFSE 배지) 및 텔로 펩티드 영역이없는 정의 된 I 형 콜라겐 인 아텔로 콜라겐으로 3D 배양하여 32.0 ± 9.8 %로 가장 높은 구형의 형성 효율이 다양한 크기의 형성된 원형의 회전 타원체 (암 유래의 Matrigel 달리) 임상 용도에 198.0 ± 22.3 배 (도.의 증폭률 수  1 B, D , 보충 그림 S1ㅏ). 이러한 조건에서 pelage 상피 세포가 확장 될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 interfollicular 상피 세포와 pelage HFSC를 포함하여 휴지기 등 피부에서 분리 된 상피 세포를 배양했습니다. vibrissa 팽창 세포와 유사하게, 하나의 백 피부 상피 세포는 23.0 ± 9.8 %의 구형 형성 효율에 거친 표면 타원체 야기 7.3 ± 2.6 배의 증폭률 (도. 수득  한 (C), (D) 참조). vibrissa bulge cell과 back skin cell의 차이는 각 세포 집단에서 HFSC의 비율과 모발주기 단계 때문일 수 있습니다. NFFSE 조건은 CD34 + / CD49f + 세포의 비율을 vibrissa에서 66.1 %, 등 피부 세포에서 70.8 %까지 크게 증가 시켰습니다 (그림  1이자형). 이과 일치, 실시간 정량 PCR (qPCR에)에 의한 유전자 발현 분석의 표현에 상향 조절을 밝혀 CD34 , CD49f 및 유형 17 세 콜라겐 ( Col17a1 ), 자신의 유지 보수에 관련된 벌지 HFSCs 마커 (24) vibrissa 다시 피부 모두에, 유의 한 상향 조절은 관찰되지 않았다 동안 세포 Lgr5 줄기 세포 마커는 털 가죽의 HF의 운명을 낮추는 노력이나 대 Blimp1 상부 HF 세포 및 피지선 줄기 세포 (도.의 마커  1 F 보충도. S1의 b) . Lhx2 및 Sox9를 포함한 다른 기존 줄기 세포 마커의 발현 변화, 세포 유형 및 모발주기 단계의 차이로 인해 세포 공급원에 따라 달라집니다. 개별 타원체의 면역 조직 화학적 분석은 상기 두 vibrissa-과 털 가죽 유래 세포 (도. qPCR에있는 데이터를 확인  1 g)을. 이러한 데이터는 Noggin, FGF7, FGF10, SAG 및 EGF를 포함하는 배지와 함께 아텔로 콜라겐을 사용한 3D 배양이 CD34 + / CD49f + 세포의 증폭률이 향상되고 CD34 + / CD49f + 세포의 확장에 필요한 배양 기간이 더 짧다는 것을 나타냅니다. 이전에보고 된 방법 21 .

NFFSE 배지에서 배양 된 벌지 세포는 시험관 내에서 다 능성을 나타냅니다.

NFFSE 배지에서 배양 된 세포가 미분화 상태와 다 분화능을 유지하는지 여부를 조사하기 위해 배양 조건을 더욱 개발하여 HFSC의 운명을 수정할 수있었습니다.

우리는 NFFSE 배지 (NFFS 배지)에서 EGF를 회수하고 Wnt 리간드, Notch 리간드 및 TGF-β 억제제 (NFFSWN 배지)를 첨가하면 콜로니 형성 효율, 콜로니 크기, 증폭률 및 백분율이 감소하는 것으로 나타났습니다. CD34 / CD49f 이중 양성의 (CD34 + / CD49f +) 세포 (도.  (2) A, J, 기업도. S1 a). 중요한 NFFS- 및 NFFSWN 배양 세포는 각각 (도. 하부하는 이러한 세포의 의지와 상부 HF 운명을 시사 Lgr5 또는 Blimp1 높은 수준의 발현  2 K, L, 기업도. S1의 B 및 S2를a, b). 마이크로 어레이 및 HF 과도 증폭 이전에 발행 유전자 발현 프로파일 후속 클러스터링 분석 (TA) 세포 NFFS 배양 vibrissa 세포의 유전자 발현 프로파일 TA 셀과 동일한 것을 확인했다 (25) (도.  2 M). 또한, 우리는 NFFSE 배양 세포는 고도로 포함한 줄기 세포 유지에 관여하는 다수의 전사 인자 발현 것으로 Klf4 26 , 27 NFFS 매체 (도.에서 배양 된 세포와 비교하여,  2 N).

그림 2

NFFSE 배양 된 세포는 시험관 내에서 다 능성을 나타냅니다 . ( a , b ) 6 개 동안 배양 된 스페 로이드의 위상차 이미지는 NFFS ( a ) 및 NFFSWN 배지 ( b ) 에서 말합니다 . ( c , d ) 표시된 배지에서 배양 된 세포의 콜로니 형성 효율. ( e , f ) 표시된 배지에서 배양 된 세포의 증폭 속도. ( g , h ) NFFS- ( g ) 및 NFFSWN- 배양 된 표피 세포 ( h )의 복제 FACS 플롯 . ( i , j ) 갓 분리되거나 배양 된 세포에서 표시된 마커의 qPCR 분석. (k , l ) 배양 된 스페 로이드에 표시된 마커의 대표적인 면역 형광. ( m ) NFFSE- 및 NFFS- 배양 된 세포와 모낭의 TA 세포로부터 얻은 어레이 데이터의 클러스터링 분석. ( n ) 마이크로 어레이 분석에서 NFFSE와 NFFS 조건간에 차별적으로 표현되는 줄기 세포 유지와 관련된 선택된 전사 인자의 히트 맵. ( o ) 시험 관내 분화 분석의 실험 계획. 성체 생쥐 vibrissa의 돌출부 또는 pelage HF를 포함한 등 피부에서 분리 된 상피 세포를 NFFSE 배지에서 6 일 동안 배양 한 다음 NFFSE, NFFS 또는 NFFSWN 배지로 통과시켰다. ( p ) 6 일째에 배양 된 vibrissa 및 pelage HF의 위상차 이미지. (q ) 계대 후 6 일째에 표시된 배양 배지에서 콜로니 형성 효율. ( r ) 표시된 매체에서 통과 후 증폭 속도. ( s ) 표시된 배지에서 계대 후 배양 된 세포의 복제 FACS 플롯. ( t ) 배양 된 세포에 표시된 마커의 복제 qPCR 분석. ( u ) 표시된 조건에서 배양 된 C57BL / 6 또는 Lgr5-EGFP 마우스의 스페 로이드에 표시된 마커의 대표적인 면역 형광. 화살촉은 표시된 마커의 표현을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. * p <0.001; ** p <0.005; **** p <0.002. 스케일 바, 20 μm. 보충 그림 S2 도 참조하십시오 .

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NFFSE 배양 된 세포의 다 분화능을 조사하기 위해 NFFSE 배지 또는 분화 배지에 계대 배양했습니다 (그림  2 o); 우리는 NFFSE 배양 세포가 NFFS 및 NFFSWN 조건에 대한 반응으로 유전자 및 단백질 발현 수준에서 콜로니 크기 및 CD34 + / CD49f + 세포 집단의 감소와 Lgr5 또는 Blimp1과 같은 커밋 된 줄기 세포 마커의 발현을 증가시키는 것을 발견했습니다 , 일차 배양에서 관찰 된 변화와 유사합니다 (그림  2 p–u, 그림 S2 c–g). 종합하면, 이러한 결과는 HFSC가 NFFSE 배지에서 비교적 미분화 된 상태를 유지함을 시사한다.

NFFSE 배양 세포는 주기적으로 모발 재생을 유도하는 능력이 있습니다.

이러한 배양 된 세포가 주기적으로 모발 재생을 유도하는 능력을 가지고 있는지 알아보기 위해 콜라겐에 장기 유도 성 상피 줄기 세포와 중간 엽 줄기 세포를 공간적으로 배열하여 조직 형성 과정에서 장기 배아 형성을 모방 한 장기 배아 방법을 사용하여 모발 재구성 분석을 수행했습니다. 젤 3 . 패치 및 챔버 분석과 같은 기존의 모발 재구성 분석과 비교할 때이 분석 시스템은 모발 재구성에 필요한 세포 수가 적고, 사용 된 세포 수당 모발 재생 효율이 높으며, HF 재생 수를 제어 할 수있는 능력을 포함하여 몇 가지 장점이 있습니다. ,이를 통해 재생 된 개별 모발 3 의 모발주기 수를 분석 할 수 있습니다.

우리는 의도적으로 CAG-EGFP 마우스와 배양 된 DPC에서 분리 된 배양 된 HF 상피 세포를 활용하여 몇 개의 모발 만 재생되는 생체 공학 비 브리사 HF 세균을 생성했습니다. NFFSE-, NFFS-, NFFSWN- 배양 세포에서 생성 된 생체 공학 배아를 이식 한 지 3 주 후, 모간의 발진과 성장이 54.5 % (n = 155), 61.2 % (n = 92), 0 % (n = 78), 각각 (그림  3 a–c). 재생 된 모간은 광학 현미경과 전자 현미경 3 (그림 3) 에서 모발 피질과 6 층의 얇은 큐티클을 포함하여 정확한 형태 학적 및 조직 학적 구조를 보여주었습니다 (그림  3).디). 두 NFFSE- 및 NFFS 배양 세포로부터 2 머리 주기로 재생 모발의 면역 조직 화학적 분석은 팽창 영역 (도.에서 CD34 및 CK15 포함한 공통 HFSC 마커를 발현하는 세포의 존재를 입증  3 전자). 장기 분석에 따르면 NFFSE 배양 세포에서 재생 된 HF의 81.0 %는 새로 분리 된 팽대 상피 세포에서 재생 된 HF와 유사한 모발주기 기간과 함께 최소 3주기의 반복적 인 모발주기를 보였습니다 (그림  3).g, h). 대조적으로, NFFS 배양 세포에서 재생 된 HF의 79.0 %는 2주기 미만의 모발 재생을 보였으며 (p = 0.002, Student 's t-test), NFFS 배양에서 주기적 모발 재생에 필요한 HFSC의 고갈을 나타냅니다. NFFSE 조건과 비교 한 조건. 이러한 결과는 NFFSE 조건에서 배양 된 세포가자가 재생 능력 외에도 모발 재생, 즉 모발주기를 주기적으로 유도 할 수있는 잠재력을 가진 HFSC가 풍부함을 시사한다.

그림 3

NFFSE 배양 세포는 반복적 인 HF 재생 능력을 가지고 있습니다. ( a ) 표시된 배지에서 배양 된 비 브리사 벌지 세포로부터 생성 된 이식 된 생체 공학 HF 생식의 거시 형태 관찰. 성체 vibrissa HF에서 분리 된 배양 된 HF 상피 세포와 진피 유두 세포에서 생성 된 생체 공학 HF 배아를 누드 마우스의 등 피부에 피내 이식 하였다. ( b ) 이식편 생존율의 정량화, ( c ) 이식 후 첫 번째 모발 성장률의 정량화. ( d ) 광 현미경, 주사 전자 현미경 (SEM) 및 투과 전자 현미경 (TEM)에 의한 재생 된 모간의 현미경 관찰. ( e) 재생 된 HF에 표시된 마커의 대표적인 면역 형광. ( f ) 재생 된 HF의 장기 모발주기 분석. ( g ) 표시된 모발주기 수 ( s )를 보여주는 재생 된 HF의 백분율 정량화 . ( h ) 각 모발주기에서 모간이 있거나없는 기간의 정량화. 화살촉은 ( a , f ) 에서 재생 된 모간 , ( d ) 에서 큐티클 레이어 , ( e ) 에서 표시된 마커의 표현을 나타냅니다 . 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. * p <0.01. 스케일 바, 100 μm in ( a , f); ( d ) 의 왼쪽 및 중간 패널에서 20 μm 및 오른쪽 패널에서 2 μm ); 20 μm in ( e ).

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CD34 + / CD49f + / Itgβ5 + 세포는주기적인 모발 재생에 필수입니다.

줄기 세포자가 재생은 공간적으로 구별되는 미세 환경 (틈새) 및 세포 접착 분자에 의해 유도되는 내인성 및 외인성 단서에 의해 엄격하게 조절되며, ECM은 조혈 및 중간 엽 줄기 세포를 포함한 여러 줄기 세포주를 유지하는 데 중요한 역할을합니다 10 , 11 , 12 , 24 , 28 , 29 , 30 .

20 개 이상의 세포 표면 마커에 대한 FACS 분석은 NFFSE 배지에서 배양 된 세포에 CD34 + / CD49f + / Itgβ5 + 세포가 풍부하다는 것을 보여 주며, 이는 또한 새로 분리 된 pelage HF의 벌지 세포에도 존재했습니다 (그림  4 a, b 그림 S3 ). vibrissa HF의 돌출 부위는 낮은 수준의 CD34를 발현했지만, 높은 수준의 Itgβ5를 발현하는 CD49f + 기저 세포가 존재했습니다 (그림  4).ㅏ). CD34 + / CD49f + / Itgβ5 + 세포의 기능적 중요성을 조사하기 위해 우리는 표적 세포를 안정적으로 제거 할 수있는 모발 재구성 분석을 이용했습니다. FACS 분리 후 NFFSE 배양 된 pelage 상피 세포를 활용하여 모발 재구성 분석을 수행 한 결과 CD34 + / CD49f + / Itgβ5- 세포와 CD34 + / CD49f + / Itgβ5 + 세포가 혼합 된 집단에서 43.2 % (n = 57)의 빈도로 모발 재생이 발생 함을 발견했습니다. 62.5 % (N = 48), 각각 (도.  4 C, D). 놀랍게도, Itgβ5 + 세포가 생체 공학 HF 세균에 존재할 때 적어도 3주기의 모발주기를 보여주는 재생 된 HF의 비율은 13.3 %에서 79.9 % (p = 0.002, Student 's t-test)로 급격히 증가했습니다 (그림  4).c, e). 또한, CAG-EGFP 마우스의 NFSSE 배양 된 골지 상피 세포에서 FACS로 분리 한 CD34 + / CD49f + / Itgβ5 + 세포와 배아 일 (ED) 18 마우스 배아에서 분리 한 피부 상피 세포를 a에서 혼합하여 경쟁 모발 재구성 분석을 수행했습니다. 1 : 9 비율. 재생 모발의 조직 학적 분석은 GFP 양성 세포는 여러 세포 계통 피지선, 벌지, 헤어 전구 (도. 모발을 포함하여, 구성을 초래했다 밝혀  4 F 참조). 종합하면, 이러한 결과는 CD34 + / CD49f + 세포 집단 중 Itgβ5 + 세포가 다 분화능이며 모발 재생의 장기 주기적 유도에 중요하다는 것을 분명히 보여주었습니다.

그림 4

Itgβ5 + 세포는 반복적 인 HF 재생을 위해 필요합니다. ( a , b ) 표시된 마커에 대해 새로 분리 된 ( a ) 및 배양 된 세포 ( b ) 의 복제 FACS 플롯 . ( c ) CD34 + / CD49f + / Itgβ5 세포 (하부 패널) 및 CD34 + / CD49f + / Itgβ5 + 세포 (상부 패널)와 혼합 된 CD34 + / CD49f + / Itgβ5 세포에서 생성 된 이식 된 생체 공학 HF 세균의 장기 거시 형태 관찰. ( d ) 이식 후 첫 번째 모발 성장 속도의 정량화. ( e ) 표시된 모발주기 수 ( s )를 보여주는 재생 된 HF의 백분율 정량화 . ( f) 재생 된 HF에 표시된 마커의 대표적인 면역 형광. CAG-EGFP 마우스의 NFSSE 배양 된 pelage 상피 세포에서 분리 된 CD34 + / CD49f + / Itgβ5 + 세포를 ED18 마우스 배아에서 분리 한 새로 분리 된 피부 상피 세포와 1 : 9 비율로 조합하고 배아 진피 세포를 사용하여 생체 공학적 장기 배아를 생성하도록 처리했습니다. 오른쪽 패널은 왼쪽 패널의 박스 영역이 높은 배율을 나타냅니다. 화살촉은 재생 된 모간을 나타냅니다. sg, 피지선. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 스케일 바, 50 μm in ( g ); ( d ) 에서 100 μm . 보충 그림 S3 도 참조하십시오 .

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Itgβ5 + 세포는 천연 모낭에서 테나 신으로 둘러싸인 상부 돌출 부위에 위치합니다.

HF는 개별 틈새 시장 10 , 11 , 12에 여러 유형의 운명 제한 줄기 세포를 보유하고 있습니다 . 이전 연구에서 전문화 된 HF 틈새가 테나 신 및 카데 린과 같은 독특한 ECM 단백질의 발현과 관련이 있음을 나타내었지만, ECM의 기능적 중요성은 Col17a 및 네 프로 넥틴을 제외하고는 거의 알려지지 않았습니다. 24 , 29 , 30 . CD34 + / CD49f + / Itgβ5 + 세포가 네이티브 HF에 존재하는지 여부를 조사하기 위해, 그렇다면 이러한 세포의 틈새가 무엇인지 조사하기 위해 우리는 Itgβ5와 잠재적으로 인테그린에 결합 할 수있는 다양한 세포 표면 수용체 및 ECM 단백질에 대한 면역 조직 화학적 분석을 수행했습니다. 그림  5ㅏ). 마우스 vibrissa의 모발에서는 Itgβ5 + 세포는 팽창 영역의 상부에 위치하며, CK15 (도. 표현되는  5 A 및 기업도. S4의 B 참조). Tuj-1 + 신경 세포의 신경 분포를 관찰하였고, Shh 신호 전달의 구성 요소 인 Gli1의 발현이 Itgβ5 + 영역의 하부에서 발현되었다 (보충 그림 S4 b). 또한, 우리는 Itgβ5 + 세포가 존재하는 상부 돌출 부위가 tenascin-C (TN-C)로 둘러싸여 있음을 발견했습니다 (그림  5 a, e). 마우스 pelage HF에서 vibrissa HF와 유사하게 Itgβ5 + 세포가 CK15 발현 상부 돌출 부위에서 관찰되었으며, 여기서 신경 분포 및 Gli1 발현도 관찰되었습니다 (그림  5a 및 보충 그림 S4).비). vibrissa HFs와 달리, pelage HFs의 Itgβ5 + 세포는 tenascin-N (TN-N)의 발현에 의해 정의 된 상부 벌지 영역에서 발견되었습니다 (그림  5 a, e). 인간 두피 HF에서 Itgβ5 + 세포는 TN-C와 TN-N을 모두 발현하는 ECM과 관련된 영역에서 발견되었습니다 (그림  5a ). Itgβ5 + 세포에서 테나 신의 기능적 유의성을 조사하기 위해 재조합 TN-C 단백질과 중화 항체를 이용한 세포 배양 분석을 수행 한 결과 통계적으로 유의 한 차이는 없지만 6 일째에 CD34 + / CD49f + / Itgβ5 + 세포의 비율이 확인되었습니다. 배양에서 TN-C의 용량이 증가함에 따라 증가하는 경향이 있습니다. 이 효과는 TN-C 항체의 첨가에 의해 중화되었으며, 콜로니 형성 효율, 후기 증폭 ​​및 콜로니 크기에는 영향을 미치지 않았습니다 (그림 1a). 4 b–d, 보충 그림 S5 a, b). 테나 신과 Itgβ5 + 세포의 기능과 인과 관계를 생체 내에서 조사해야하지만,이 결과는 CK15 발현 벌지 줄기 세포에서 이질적인 하위 집단의 존재와 Itgβ5 + 세포가 장기 유지에 역할을 할 가능성을 시사합니다. 생체 내 기간 모발주기. 또한, 테나 신의 발현에 의해 정의 된 돌출부의 상부는 Itgβ5 + 세포의 가능한 틈새입니다.

그림 5

Itgβ5 + 세포는 마우스와 인간의 천연 모낭에서 테나 신을 둘러싼 상부 돌출 영역에 위치합니다. ( a ) 네이티브 마우스 비 브리사, 펠라 지 및 인간 두피 HF에 표시된 마커의 면역 형광. 오른쪽 패널은 왼쪽 패널의 박스 영역이 높은 배율을 나타냅니다. ( b ) 재조합 TN-C 단백질 및 TN-C 중화 항체를 사용하여 표시된 조건에서 배양 된 비 브리사 벌지 세포의 콜로니 형성 효율. ( c ) 표시된 조건에서 배양 된 vibrissa bulge 세포의 증폭 속도. ( d ) 배양 된 비 브리사 벌지 세포의 복제 FACS 플롯. ( e) 천연 비 브리사 및 펠라 지 모낭에서 Itgβ5 + 세포, CK15 양성 세포 및 테나 신 -C / N 발현의 국소화에 대한 개략적 표현. 화살촉은 표시된 마커의 표현을 나타냅니다. APM, arrector pili 근육. sg, 피지선. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 축척 막대, 50 μm. 보충 무화과도 참조하십시오. S4 및 S5 .

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토론

이 연구에서 우리는 HFSC의 분화 상태를 확장하고 제어 할 수있는 다중 배양 조건을 설정하여 모발 재구성 분석에서 장기 주기적 HF 재생에 기여하는 CD34 / CD49f / Itgβ5를 발현하는 새로운 세포 집단을 공개했습니다. Itgβ5 + 세포는 테나 신 -C 및 / 또는 테나 신 -N으로 둘러싸인 벌지 영역의 가장 위쪽 영역에 위치하며, 마우스 진동 및 발기 HF뿐만 아니라 인간 두피 HF에서도 존재합니다. 이러한 연구 결과는 HFSC의 조절을 뒷받침하는 메커니즘에 대한 우리의 이해를 상당히 발전시키고 동일한 줄기 세포 마커를 발현하는 HFSC 집단에서 기능적 이질성의 가능한 존재에 대한 권리를 제공합니다. 또한 우리의 연구 결과는 HF 재생 의학의 목표에 기여할 것입니다.

과거 연구에 따르면 포유류 HF는 운명이 제한된 HFSC와 그 틈새 10 , 11 , 12 의 이질적인 집단에 의해 유지됩니다 . 더욱이, 최근의 단일 세포 분석은 CD34 14 와 같은 동일한 줄기 세포 마커를 발현하는 세포 사이에서도 이질적인 집단의 존재를 보여주었습니다 . 그러나이 기능적 이질성은 완전히 이해되지 않았습니다. 마우스와 인간 모두의 자연 HF에서 Itgβ5 + 세포는 돌출부의 가장 위쪽 영역에서 발견됩니다. 계보 추적 접근법을 사용한 과거 연구에 따르면 K15 또는 Lgr6을 발현하는 줄기 세포의 하위 집합은 하부 HF에 맡겨진 자손쪽으로 아래쪽으로 이동하거나 피지선쪽으로 위쪽으로 이동할 수 있음을 보여주었습니다 31 , 32. 이 연구에서 우리는 CD34 + / CD49f + / Itgβ5 + 세포가 모발 재구성 분석에서 주기적 모발 재생을 유도하는 능력을 가지고 있음을 발견했으며, 이는 배양 된 CD34 + / CD49f + 세포 사이에 기능적 이질성이 존재 함을 나타냅니다. 이러한 사실과 우리의 데이터를 바탕으로, 우리는 천연 HF의 상부에서 발견되는 Itgβ5 + 세포가 장기 주기적 모발 재생에 직간접 적으로 중요한 역할을한다고 추측합니다.

성체 줄기 세포는 특수한 틈새를 통해 내재적 및 외적 메커니즘에 의해 유지됩니다. 마우스의 털 가죽 vibrissa 또는 HF의 팽창 영역, 예컨대 COL17A1 (자가 재생산 및 HFSCs 유지를위한 공지 필수적 매개체) 같은 전문 ECM 단백질이 발현된다 (24) . 이전에보고 된이 연구에서는 마우스 vibrissa의 팽창 지역에서 TN-C 발현을 관찰 (30) . 더욱이, 우리는 TN-C 및 / 또는 TN-N이 인간 두피 HF 및 마우스 pelage HF에서도 발현된다는 것을 발견했습니다. 모든 테나 신은 EGF 유사 도메인 33 과 같은 동일한 분자 구조를 공유합니다 . 중합 된 TN-C 도메인이 EGF 활성화를 유도 할 수 없다는 것을 감안할 때 34, tenascin은 EGF 매개 신호 전달을 억제하여 Itgβ5 + HFSC를 정지 상태로 유지할 수 있습니다. 이 발견은 모발 재구성 분석에서 지속 가능한 모발 재생에 필요한 CD34 + / CD49f + / Itgβ5 + HFSC의 확장에 EGF가 필요하다는 것을 보여주는 배양 실험의 결과와 일치 할 수 있습니다.

포유류에서 기관 생성은 HF를 포함한 매우 제한된 기관을 제외하고 배아 발달 동안에 만 발생합니다. 수많은 선구적인 연구에서 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSC)와 성인 조직 줄기 세포가 원래 기관의 구조와 기능을 부분적으로 모방 할 가능성이 입증되었지만 전체 기관의 완전한 기능 재생은 HFs 1 , 2 , 3 에서만 달성되었습니다. , 4 , 5 , 6. 따라서 HF 재생은 장기 재생 의학의 유망한 방법이 될 수 있습니다. 지난 수십 년 동안 장기 유도 능력을 유지하면서 HFSC를 확장하는 방법을 확립하기 위해 많은 노력을 기울였습니다. 최근에 Chacón-Martínez와 동료들은 15 개의 계대 후에도 재생 능력을 유지하는 배양 방법을 확립했습니다. 현재 연구에서 우리는 HFSC 인구를 약 200 배 증가시키는 조건을 발견했으며 이는 이전 연구에서 훨씬 개선되었습니다. 더욱이, CD34 / CD49f에 더하여 Itgβ5의 발현은 모발 재생을 주기적으로 유도하는 배양 된 HFSC의 능력을 평가하는 좋은 마커가 될 수 있습니다. Chacón-Martínez와 동료 및 우리 연구 그룹의 연구 결과는 HF 재생 요법의 기술 개발을 크게 발전시킬 것입니다.

줄기 세포 유지와 세포 동역학에서 Itgβ5와 테나 신의 기능과 기전을 더 연구해야합니다. 그럼에도 불구하고이 연구에서 확인 된 문화 조건을 통해 HFSC의 분화 상태를 확장하고 제어 할 수 있으며, HFSC의 주기적 HF 재생 잠재력 유지, 계보 결정 및 여러 유형의 계층 적 관계를 유지하는 메커니즘을 이해하기위한 플랫폼을 제공합니다. HFSC. 우리의 연구는 또한 성공적인 HF 재생 요법을 달성 할 수있는 HFSC 및 그 배양 시스템의 잠재력을 입증했으며, 이는 장기 재생 의학에 대한 인간 최초의 시험이 될 것입니다.

재료 및 방법

동물

실험은 C57BL / 6N (Japan SLC Inc.), C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) (Japan SLC Inc.), BALB / cSlc-nu / nu (Japan SLC Inc.) 및 Lgr5-EGFP-IRES- creERT2 마우스 (잭슨 연구소). 동물은 환경이 통제 된 방에 보관되었으며 동물을 사용한 모든 실험 절차는 RIKEN 고베 지점의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

성인 vibrissae 및 등 피부에서 상피 세포의 분리

이전에보고 된 방법에 따라 7-8 주 된 vibrissae에서 HF 상피 세포가 분리되었습니다 3 . 성인 휴지기 등 피부의 상피 세포는 이전에 설명한 방법을 사용하여 약간의 수정 35를 사용하여 얻었습니다 . 간단히 말해서, 피하 조직을 제거한 후 등 피부를 1.0 × 1.5 cm 2 조각 으로 자르고 0.25 % 트립신 (Lifetechnologies)에서 50 분 동안 37 ° C에서 배양했습니다. 10 % FBS (BioWest), 1 % HEPES (Lifetechnologies) 및 1 % penn-strep (Lifetechnologies)를 포함하는 DMEM (Lifetechnologies)에서 겸자와 메스 블레이드를 사용하여 표피를 진피에서 분리하고 신선한 완충액으로 헹구어 기저 세포를 70 μm 스트레이너로 여과하여 모발과 각질층을 제거합니다.

상피 세포 및 진피 유두 배양

vibrissa bulge 또는 back skin에서 분리 된 총 4,500 또는 9,000 개의 상피 세포를 1 x DMEM (Lifetechnologies), 10 mM HEPES (DOJINDO) 및 10 mM NaHCO와 혼합 된 90 μl의 1 % Atelocollagen 용액 (KOKEN)에 재현 탁했습니다. 3 (와코). 아테로 콜라겐 고화 후, 세포 배양 배지 (보충 표 3 ㎖에서 배양 하였다 1 ), 37 ° C, 5 % CO에서 배양 2. 계대 실험을 위해, 배양 배지에서 100U / ml Collagenase I (Worthington)로 배양 한 다음 0.05 % 트립신 (Lifetechnologies)에서 60–90 분 및 37 ° C에서 15–25 분 동안 배양하여 Atelocollagen에서 세포를 추출했습니다. 세포는 90 μl의 1 % Atelocollagen에서 9,000 세포의 밀도로 배양 6 일에 통과되었습니다. 피부 유두에 대한 배양은 이전에보고 된 방법에 따라 수행되었습니다 3 . TN-C의 기능 분석을 위해 재조합 TN-C 단백질 (R & D 시스템) 및 중화 TN-C 항체 (R & D 시스템)를 각각 3 또는 5 mg / ml 및 10 μg / ml 농도로 배양 배지에 첨가했습니다. .

스페 로이드 직경의 정량화

스페 로이드의 직경은 Cell3iMager duos (SCREEN Holdings)를 사용하여 측정하고 Microsoft Excel에서 계산했습니다.

유세포 분석

단일 세포 현탁액은 위에서 설명한대로 쥐의 비 브리사 돌출부, 등 피부 또는 배양 된 세포에서 준비되었습니다. 세포를 D-PBS (nacalai tesque), 0.2mM EDTA (Wako) 및 0.05 %의 BSA (sigma)로 구성된 FACS 버퍼로 한 번 헹구고 4 ° C에서 15 분 동안 항체로 염색했습니다 (보충 표 2 ). FACS 완충액으로 2 회 세척 한 후, BD FACSAria III를 사용하여 세포를 분석하고 분류했습니다. 데이터는 FACSDiva (BD biosciences) 또는 Weasel 버전 3.5를 사용하여 분석되었습니다.

qPCR

RNA는 RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen)를 사용하여 분리되었고, cDNA 합성을 위해 SuperScript VILO (LifeTechnologies)를 사용하여 역전사되었습니다. SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Bio)를 사용하여 Applied Biosystems QuantStudio 12 K Flex (Life Technologies)에서 실시간 qPCR을 수행했습니다. 데이터는 β- 액틴 발현으로 정규화되었습니다. 실시간 qPCR에 사용되는 프라이머 쌍은 보충 표 3에 나열되어 있습니다.

면역 조직 화학

스페 로이드와 피부 조직에 대한 면역 조직 화학적 분석은 이전에보고 된 방법에 따라 약간의 수정 36으로 수행되었습니다 . 형광 면역 조직 화학은 냉동 섹션 (10 및 50μm) 및 파라핀 섹션 (10μm)에서 수행되었습니다. 파라핀 절편은 항원 회수를 위해 95 ° C에서 40 분 동안 1mM EDTA pH8.0 또는 표적 회수 용액 pH9.0 (DAKO)에서 배양되었습니다. 모든 형광 현미경 이미지는 LSM 780 및 LSM 880 공 초점 현미경 (Carl Zeiss) 또는 Axio Scan.Z1 (Carl Zeiss)으로 얻었습니다. 면역 조직 화학에 사용되는 항체는 보충 표 4에 나열되어 있습니다.

마이크로 어레이 분석

RNeasy Plus micro Kit (Qiagen)를 사용하여 배양 된 세포에서 총 RNA를 추출한 후 GeneChip 3 'IVT PLUS Reagent Kit (Thermo Fisher Science)를 사용하여 비오틴 화 된 cRNA를 합성했습니다. 표지 된 cRNA는 Mouse Genome 430 2.0 Array (Affymetrix)에 혼성화되었습니다. 데이터는 Affymetrix GeneChip Command Console Software (Affymetrix) 및 Transcriptome Analysis Console (Appliedbiosystems)로 분석되었습니다. 선택된 전사 인자에 대한 히트 맵은 Heatmapper 37을 사용하여 생성되었습니다 . 데이터 세트는 액세스 코드 GSE160632로 유전자 발현 옴니버스 (GEO) 데이터베이스에 저장되었습니다.

생체 공학 HF 세균의 재구성 및 이식

장기 배아 방법과 이식하여 생명 공학적 장기 세균의 재구성은 상기 방법에 따라 수행 이전에보고 하였다 3 . 장기 모발주기 분석을 위해 모든 이식 부위를 기록하고 SteREO Lumar V12 및 AxioCam 형광 입체 현미경 시스템 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 최대 6 개월 동안 일주일에 2 ~ 3 회 분석했습니다.

전자 현미경

전자 현미경 분석은 이전 연구 3 에서 설명한대로 수행되었습니다 .

통계 분석

학생의 t- 검정은 양측 검정을 통해 Microsoft Excel에서 P 값을 계산하는 데 사용되었습니다.

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참조 다운로드

감사의 말

RIKEN BDR의 연구실 구성원, 특히 Drs. A. Noma 및 A. Shiokawa, Ms. C. Fukuda, Ms. Y. Higuchi, Ms. T. Iga, Ms I. Konishi, Ms. Y. Morioka, Ms. M. Takase, Ms. Y. Tamai, Ms 기술 지원을위한 Y. Uchiyama 및 동물 시설. 우리는 또한 Y. Mori, Mr. K. Kishimoto, Mr., S. Kobori 및 Mr. M. KYOCERA Corporation의 Mr. M. Yoshida, 그리고 Organ Technologies Inc.의 N. Okamoto에게 큰 지원과 격려를 해주셔서 감사합니다. 계획. 이 작업은 JSPS KAKENHI (Grant Numbers : JP25242041 및 JP16H01851 to TT; JP16H07454 to MT), The Naito Foundation 및 RIKEN Incentive Research Projects to MT에 의해 지원되었습니다. KYOCERA Corporation과 Organ Technologies Inc.의 자금 지원에 감사드립니다.

작가 정보

저자 노트

1. 이 저자들은 다케오 마코토와 아사카와 쿄스케로 동등하게 기여했습니다.

제휴

1. 장기 재생 연구소, RIKEN 발달 생물학 센터 (CDB) 및 RIKEN 생물 시스템 역학 연구 센터 (BDR), Hyogo, 650-0047, 일본

   다케오 마코토, 아사카와 쿄스케, 도요 시마 코 에이, 오가와 미호, 츠지 다카시

2. Organ Technologies Inc., Tokyo, 101-0048, Japan

   코 에이 도요 시마, 오가와 미호, 츠지 다카시

3. 일본 효고현 관세이 가쿠 인 대학 과학 기술 대학원 생명 과학과 669-1337

   징징 통 & 츠지 타카시

4. 이와테 현 이와테 의과 대학 병리학과 해부학 및 세포 병리 학부, 028-3694, 일본

   타 로우 이리에

5. 일본 가나가와 현 기타 사토 대학교 의과 대학 성형 외과학 교실 252-0375

   야나기사와 마사유키, 츠지 타카시

6. 일본 도쿄 게이오 대학 의과 대학 성형 및 재건 외과학과, 160-8582

   사토 아키오 & 츠지 타카시

기여

MT와 TT는 연구 계획을 설계했습니다. MT는 프로젝트를 조정하고, 대부분의 실험을 수행하고, 데이터를 분석하고, 수치를 준비했습니다.; KA는 3D 배양 시스템을 개발하고 배양 된 세포의 기능 분석을 수행했습니다.; JT, MO, KT가 실험을 수행했습니다.; TI는 전자 현미경 분석을 수행했습니다. MY와 AS는 프로젝트에 대한 인간 샘플, 과학적 조언 및 전문 지식을 제공했습니다. MT와 TT가 원고를 썼습니다.

교신 저자

츠지 타카시에 대한 대응 .

윤리 선언

경쟁 관심

TT는 Organ Technologies Inc.의 이사입니다.이 작업은 부분적으로 RIKEN, KYOCERA Corporation 및 Organ Technologies Inc. 간의 발명 계약 조건하에 수행되었습니다. 나머지 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

추가 정보

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